Escrito por Wagner Azambuja
Cromatografia e CCD
Idealizada por volta de 1900, a cromatografia é um método químico-físico de separação que possibilita identificar e isolar os componentes de uma mistura, como de um óleo essencial. Para isso, ela se baseia na migração diferencial dos componentes desta mistura entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária (fixa). A fase estacionária, neste caso, é a responsável por reter, de acordo com a afinidade química, os componentes da mistura. Já a fase móvel, por outro lado, é quem vai arrastar a mistura pela fase estacionária. Inclusive, é a grande variedade de combinações entre essas fases que fazem da cromatografia uma técnica extremamente versátil. Dentre as diversas técnicas cromatográficas, a cromatografia em camada delgada (CCD) é uma das mais utilizadas em virtude da sua simplicidade, rapidez e baixo custo. É, por exemplo, a técnica mais escolhida para o acompanhamento de reações orgânicas e para a identificação de frações coletadas em cromatografia líquida clássica. Neste método, a fase estacionária é constituída por uma fina camada de granulado (como sílica, alumina e poliamida) depositada sobre uma placa inerte, quase sempre de vidro, com espessura de 3 a 4 mm. Já a fase móvel, por sua vez, é bastante variável, sendo comum o emprego de solventes com polaridade média em relação à polaridade dos elementos que compõem a mistura.
CCD do Extrato de Calêndula
Com o objetivo de melhor ilustrar a técnica de CCD, segue abaixo a sequência de passos que possibilitou identificar, mediante este processo, a presença do flavonóide rutina em uma amostra de extrato etanólico de calêndula. Antes de começar, no entanto, é importante alertar que este artigo visa apenas e tão-somente a elucidação da técnica, pois como a rutina não é o marcador quimiotaxonômico da calêndula, este elemento pode não ser encontrado em outras análises. Mãos a obra! Em primeiro lugar (é claro), foi necessário preparar o extrato, o qual foi obtido a partir dos capítulos florais da Calendula officinalis por turbólise (liquidificador), utilizando-se 20 g de calêndula em 200 ml de solução etanólica a 80%.
Com o extrato pronto, foi a hora de preparar a fase móvel, a qual foi obtida misturando-se 7,3 ml de álcool puro, a 96%, em 2,7 ml de água (álcool 70%). Na sequência, foi feito um pequeno risco a cerca de 1 cm da base inferior da placa de sílica (fase estacionária) para marcar o local de aplicação do extrato. Com isso, a fase móvel foi cuidadosamente transferida para a cuba cromatográfica de vidro. O cuidado, neste caso, é importante, pois a altura da fase móvel não deve ultrapassar o ponto de aplicação do extrato na placa (1 cm). Por fim, com o auxílio de um capilar, o extrato foi aplicado no ponto indicado.
A placa, então, foi mergulhada na cuba e esta foi devidamente tampada para se evitar a volatilização. Imediatamente, o solvente (fase móvel) começou a subir por capilaridade pela placa, arrastando consigo os componentes menos adsorvidos na fase estacionária. Na cuba, a placa permaneceu até o momento em que o solvente atingiu, aproximadamente, 2 cm da sua extremidade superior, fornecendo como resultado uma visível mancha amarelada.
A placa, na sequência, foi retirada da cuba e levada, após a evaporação do solvente, para a revelação em uma câmara de luz ultravioleta. Afinal, sabe-se que a Calendula officinalis apresenta vários compostos que absorvem energia na faixa do UV, como flavonóides e polifenóis.
Conforme mostra a imagem acima, foi possível concluir que estes compostos, realmente, estavam presentes no extrato. Porém, só o fato da mancha absorver energia na faixa do UV não serve como parâmetro para a identificá-los. É nesta etapa do processo que a CCD lança mão do seu mais importante recurso, o fator de retenção. O fator de retenção nada mais é do que a razão entre a distância percorrida pela substância em questão (extrato de calêndula) pela distância percorrida pela fase móvel, que, neste exemplo prático, deu 0,4. Como 0,4, nestas mesmas condições, é o valor padrão obtido pela CCD da rutina, um flavonóide conhecido por vitamina P, foi possível concluir que a rutina estava presente neste extrato. Entretanto, isto não significa que a amostra era formada apenas por este elemento (é lógico).
Rutina
A rutina, heterósido do quercetol, é um flavonóide que exerce ação vasoprotetora ao atuar sobre a resistência e permeabilidade capilar, o qual se conhece como efeito vitamínico P. Por isso, é bastante utilizada para o tratamento de estados que se caracterizam por hemorragia e excessiva fragilidade capilar (prevenção de varizes).
Perfeito esse texto, me ajudou bastante a entender a CCD. Obrigada!!!