Cromatografia e Cromatograma

A cromatografia gasosa é o método que permite analisar misturas de constituintes voláteis termicamente estáveis. É, portanto, a técnica utilizada para os óleos essenciais. Nela, a fase móvel é representada por um gás, o chamado gás de arraste, cujo hélio (He) é o mais empregado. Ele não interage com a amostra, ou seja, apenas faz o papel de “carrier” para carrega-la através da coluna (fase estacionária). Este gás, para poder ser utilizado no equipamento, deve atender a 3 requisitos: 1) deve ser inerte. Isto significa que ele não pode reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. 2) deve ser puro, ou seja, isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. 3) deve ser compatível com o detector. Por exemplo: no caso do detector de ionização de chama (FID), os gases compatíveis são N₂, He, ar e H₂. No forno do CG (ou GC – gas chromatography), tem-se a coluna (fase estacionária). Estas colunas podem ser: 1) capilares, onde o diâmetro varia de 0,10 a 0,50 mm, 5 a 100 m de comprimento, feitas de aço ou vidro cuja fase estacionária é depositada como filme aplicado diretamente às paredes do tubo. 2) empacotadas, de diâmetro variando de 3 a 6 mm, com 0,5 a 5 m de comprimento, feitas de vidro ou metal onde a fase estacionária também é depositada como filme, sobre as partículas de um suporte adequado. Sobre o forno, este deve operar em temperaturas de até 400º C, com fácil acesso à coluna (para facilitar a substituição), e, aquecimento e resfriamento rápidos. Aliás, depois de 1980, a temperatura dos fornos em CG passou a ser totalmente controlada por microprocessadores.

Os detectores são os dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. Grosseiramente, “geram os picos” do cromatograma. Em CG, os mais importantes são: 1) detector por condutividade térmica (DCT ou TCD); 2) detector por ionização em chama (DIC ou FID), cujos íons são gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H₂ + ar; 3) detector por captura de elétrons (DCE ou ECD), onde ocorre a supressão da corrente pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. Destes, o FID é o mais comumente utilizado, porém, não serve para a análise de gases. PS: o usuário deve se atentar para a temperatura do FID, a qual deve estar sempre maior que a temperatura do final da coluna. No caso dos óleos essenciais, além do CG, é importante que se tenha um espectrômetro de massas acoplado, o qual será o responsável por caracterizar as moléculas pela medida da relação massa/carga de seus íons. Trocando em miúdos, é quem permite identificar os compostos desconhecidos, quantificar os compostos conhecidos e, ainda, elucidar estruturas moleculares. Ou seja, grosso modo, o CG é quem faz a varredura na mistura em busca de seus componentes, e, o MS (espectrômetro de massas), é quem faz a identificação destes; ao comparar a relação massa/carga de seus íons com uma biblioteca de moléculas conhecidas. Logo, para as análises de óleos essenciais, onde não existe um “padrão”, o GC-MS – geralmente com detector FID, é o equipamento mais utilizado.

É o gráfico que “traduz” os resultados da análise cromatográfica, possibilitando assim a leitura e a identificação dos componentes da mistura. Neste gráfico, cada substância é representada por picos – cujo número de picos depende da precisão do cromatógrafo, da finalidade prática do experimento e também, é claro, da complexidade da amostra. É por isso que alguns cromatogramas exibem apenas 3 picos e outros, sobretudo de trabalhos científicos, 100 ou mais para uma mesma amostra. A figura abaixo, por exemplo, representa o cromatograma de um óleo essencial de lavanda (Lavandula officinalis) qualquer. No eixo das abscissas, tem-se o “tempo” (t), em minutos. Então, nota-se que o componente do pico [1] foi a substância de destaque que mais rapidamente surgiu. Por isso, [1] foi a menos retida na fase estacionária, e, portanto, a que possui maior afinidade com a fase móvel. Em contrapartida, [5] foi a mais retida. Tecnicamente, diz-se que [5] é a que tem maior adsorção, logo a que se moveu mais lentamente pela coluna. Já o eixo das ordenadas registra a força do sinal por meio de um impulso elétrico, o qual só faz sentido a partir da calibração do equipamento com uma solução padrão conhecida. No entanto, como os óleos essenciais são misturas complexas, é inviável adquirir e calibrar os equipamentos com todos os padrões, até porque, em muitos casos, nem existe o padrão correspondente. Por esta razão, para estes óleos, aceita-se a análise feita pela “normalização de áreas”, que basicamente faz uma regra de três com a soma da área produzida por todos os picos (exceto o solvente) com a área de cada pico, individualmente. Assim, grosso modo, o eixo das ordenadas é o que representa as concentrações de cada substância numa amostra. Voltando ao exemplo abaixo, vê-se que [2] e [4] são as substâncias que estão em maior proporção no óleo. Além disso, os cromatogramas também devem conter as informações sobre o “método de análise”, que irá especificar o modelo do cromatógrafo, da coluna, do injetor, do detector e detalhes sobre as injeções. Muitas vezes, inclusive, o documento final que é entregue ao solicitante também já contém os nomes dos componentes identificados, algo que só é possível desde que a análise tenha sido feita com um espectrômetro de massas acoplado ao sistema.

De acordo com o cromatograma esta amostra contém:

1 – 3,4% de limoneno, que apresenta atuação terapêutica no tratamento do câncer, protege o tecido pulmonar e tem efeito solvente sobre as células adiposas e colesterol ruim.
2 – 30,9% de linalol, que é bactericida, fungicida, acaricida, ansiolítico (reduz a ansiedade), sedativo e antidepressivo.
3 – 3,3% de cânfora, que é estimulante da pressão sanguínea, anti-séptico e anestésico.
4 – 29,3% de acetato de linalila, que é antiinflamatório.
5 – 16,1% de acetato de citronelila, que é antimicrobiano e bactericida.

A sinergia destes componentes, juntamente com os outros, em quantidades menores, fornecem a atuação terapêutica do óleo essencial de lavanda – que é indicado para contusões, dores musculares, distúrbios gástricos, queimaduras, inflamações provenientes de picadas de insetos, insônia, dentre outros.